雙向電泳樣本制備技術服務

  
PDF下載技術服務資料-雙向電泳樣本制備
主要儀器
細胞超聲破碎儀、超聲清洗儀、低溫高速離心機、核酸蛋白定量儀、研缽、震蕩混合器、低溫及超低溫冰箱、組織勻漿器、細胞刮等。
試劑耗材
250mM蔗糖水(蔗糖250mM/Tris-HCl 20mM pH7.4)、液氮、丙酮、TCA、BCA定量試劑盒、玻璃珠(0.4-0.6mm)、研磨沙、DTT、TPB、IAA、PMSF、裂解液(7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、20mMTris-HC pH7.4)、再水化液(7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS) IPG buffer、溴酚藍等。
注:1.除蛋白定量及特別提示外,操作均在冰上進行;2.亞細胞組分及特殊組織提取不包括在本方法中。
 
一.培養細胞的樣本制備
1. 貼壁細胞:棄培養基、吸干;用250mM 4蔗糖水洗滌兩次吸干;10cm培養皿加300μl裂解液1% IPG buffer,用細胞刮刮下細胞后收集在1.5ml EP管中。
   懸浮細胞:離心、棄培養基;用250mM蔗糖水洗滌兩次,盡量吸掉殘夜;108細胞用300μl裂解液、1% IPG buffer,轉移到1.5ml EP管中。
2. 細胞超聲破碎儀超聲,0.8秒開/3.2秒關,10次。
3. 20000g、4℃、20分鐘離心,將蛋白層轉移到新EP中。
4. 4倍體積丙酮(-20℃預冷),搖均后-20℃過夜。
5. 12000g、4℃、30分鐘離心,倒掉丙酮,吸干。
6. 等管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸頭攪碎蛋白塊,超聲幫助溶解。
7. BCA法定量
 
二.動物組織的樣本制備
1.將100mg左右組織剪碎,250mM 4蔗糖水洗盡血色。離心去掉蔗糖水。
2.軟組織:加300μl裂解液、5mMTPB、1% IPG buffer及PMSF后在機械勻漿器中勻漿至不見組織塊。硬組織:液氮研磨至粉末狀,收集到EP管中加300μl裂解液、5mMTPB、1% IPG buffer及PMSF裂解。
3.細胞超聲破碎儀超聲,0.8秒開/3.2秒關,10次。
4. 20000g、4℃、20分鐘離心,將蛋白層轉移到新EP管中。
5. 4倍體積丙酮(-20℃預冷),搖均后-20℃過夜。
6. 12000g、4℃、30分鐘離心,倒掉丙酮,吸干。
7.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸頭攪碎蛋白塊,超聲幫助溶解。
8.BCA法定量
 
三.細菌的樣本制備
1. 將25ml細菌樣本常溫離心,棄培養基,吸干;10ml 37 250mM蔗糖水洗滌兩次,1ml再次重懸,轉移至1.5EP管中洗滌;加300μl裂解液、1% IPG buffer。
2.細胞超聲破碎儀超聲,0.8秒開/3.2秒關,15次。
3. 20000g、4℃、20分鐘離心,將蛋白層轉移到新EP管中。
4. 4倍體積丙酮(-20℃預冷),搖均后-20℃過夜。
5. 12000g、4℃、30分鐘離心,倒掉丙酮,吸干。
6.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸頭攪碎蛋白塊,超聲幫助溶解。
7.BCA法定量。
 
四.真菌的樣本制備
1. 收集真菌,棄培養基,吸干;冷ddH2O洗滌兩次,轉移至1.5ml EP管中,去掉ddH2O,加300μl裂解液、1% IPG buffer及PMSF、玻璃珠。
2. 將上述EP管劇烈震蕩2min,然后冰上放置2min;重復5次。
3. .細胞超聲破碎儀超聲,0.8秒開/3.2秒關,十次。
4. 20000g、4℃、20分鐘離心,將蛋白層轉移到新EP管中。
5. 4倍體積丙酮(-20℃預冷),搖均后,-20℃過夜。
6. 12000g 4℃ 離心30分鐘,倒掉丙酮,吸干。
7.管壁丙酮干燥后,加入150μl再水化液,用吸頭攪碎蛋白塊,超聲幫助溶解。
8.BCA法定量。
 
五.植物葉子的樣本制備
1. 取200mg葉子ddH2O洗凈后迅速放入研缽(-20預冷)中,用液氮研磨4遍,可加入研缽沙,研磨至粉末狀。
2. 10倍體積-20℃預冷的丙酮(含有10%TCA和50mM DTT)中,搖勻,-20℃過夜沉淀。
3. 2000g、4℃、30分鐘離心,倒掉丙酮,吸干。
4. -20℃預冷的丙酮洗滌沉淀3次。
5. 200μl再水化液,用吸頭攪碎蛋白塊,超聲幫助溶解。
6. 12000g、4℃、20分鐘離心,取蛋白層。
7. BCA法定量。
 
六.血漿的樣本制備
參見去除高豐度蛋白說明書。
 
----------------------------------
北京赛车6码两期滚雪球