雙向電泳實驗技術服務資料

  
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主要儀器:
離心機、GE HealthCare雙向電泳系統、搖床、A4投射掃描儀、Typhoo9400掃描儀等。
 
試劑耗材:
見最后頁。
 
DIGE標記:
注:此為可選步驟,全程4℃、暗處操作。
1. 配好10 mM lysine,準備1ml DMF。
2. 樣本要求,樣本濃度在5-10μg/μl之間。樣本可以根據其濃度稀釋至該范圍后再定量一次。樣本需溶解在7M urea、2M Thiourea 、4%charps、30mM Tris-HCl pH8.5(4℃)中。
3. 配儲液,染料復溫5mim,離心使粉末落至管底。將染料溶于5μl DMF中,震蕩30s,離心恢復體積。此時其濃度為1nM/μl。取本實驗所需量后用封口膠封嚴管口。
4. 配工作液,以一個樣本為例: 0.4μl儲液加0.6μl DMF混合,此時其濃度400pM/μl。
5. 標記,取50μg樣本和1μl 工作液混合。反應30min。
6. 終止反應,1μl 10 mM lysine 混合后終止反應10min。
 
IEF電泳步驟:
1. 檢查膠條槽,等電聚焦儀是否水平。
2. 準備上樣液:上樣量、上樣體積、再水化液、DTT、BPB。
3. 將460μl上樣液混合均勻后,12000g離心8分鐘,取上層450μl用1ml槍將其均勻的加在膠條槽兩電極間,必須無間斷、無氣泡。
4. 取出IPG干膠條,從正極端開始小心撕下保護膜,撕到負極端時應緩慢。將其正極端頂入膠條槽的正極端,膠面朝下緩緩放入槽內,盡量使液體分布均勻,不能有氣泡。記下膠條編號和樣本號。
5. 均勻覆蓋1ml覆蓋油。蓋上蓋子
6. 編輯IPGphor的IEF程序:
      電流設置 50μA
 Step 1: 30v     10-12h, step-n-hold.
 Step 2: 500v    1h       step-n-hold.
 Step 3: 1000v   1h       step-n-hold.
 Step 4: 8000v   10h      step-n-hold.
選擇膠條總數。
Total:20-24h,<100 000vh。根據實際情況調整參數。
注:血清等高鹽樣本第二、第三步各延長一小時,并增加1000-8000v的gradient步驟;DIGE電泳應避光
7. IEF完成時,記錄總時間、總vh及8000v時間、vh等。膠條放入平衡管中,-80℃保存。
 
灌膠:
1. 準備干凈玻璃板:鏟膠后用洗潔精洗干凈,1%Decon浸泡(6塊板1000ml)過夜,海綿刷洗,自來水沖干凈,1%鹽酸浸泡過夜,海綿刷洗,沖洗干凈,ddH2O涮洗。晾干。
2. 配Bind-silane工作液:每100ml含乙醇80ml、冰醋酸2ml、水18ml、Bind-silane 100μl。
3. 用少量酒精將玻璃板擦干凈,用無塵紙將紙毛擦凈。
4. 加3.5ml Bind-silane 工作液。涂勻,注意不能涂到space上面。1h后用涂再涂濕,去除塵埃。
5. 合玻璃板。將短板用酒精擦干。合上后能在水平面上站立位標準。
6. 準備灌膠槽。塑料片、槽內側面、橡膠墊等不能沾水。在放海綿條的溝上擠滿dd水,將海綿條按進溝內,使其充分泡脹,注意不要來回扯動。
7. 對好橡膠墊子,使其處于槽中間。
8. 在槽底面放一厚塑料片(注意圓角端朝外),然后玻璃板、厚塑料板依次放置,剩余空間用薄塑料板填滿,放置時應不留空隙。
9. 裝好灌膠槽蓋子。將膠槽豎立于通風廚水平面上。
10. 準備灌膠瓶, 從4℃冰箱里取出moner、resolving buffer 。以6張12.5%膠為例:依次加入175.14ml moner,105ml resolving buffer, 4.2ml 10%SDS, 133.56ml ddH2O。除氣15分鐘。
11. 試劑柜中拿出APS和TEMED,稱好APS 0.21g,溶于2.1ml ddH2O中。
12. 往灌膠瓶中均勻緩和加入APS和138.6μl TEMED。攪拌3分鐘。
13. 沿槽斜溝緩緩灌入膠液,直到液面平space上緣。剩余膠液倒入小燒杯中。
14. 加飽和正丁醇(上層液為飽和正丁醇),沿膠面弧線緩緩向前推進滴加。
15. 用薄膜封口。過夜備用。
 
SDS-page電泳步驟:
1. 檢查灌膠是否正常。準備好二向膠。
2. 配好電泳緩沖液。用具:2000ml,800ml量筒各一個;5000ml量杯一個。上槽2X 800ml,下槽 1X 4500ml。棄掉二向膠上的水,以上槽緩沖液覆蓋之。將一半左右下槽液倒入電泳槽中,開通循環冷卻設備。
3. 配置0.5%LM及1%NA的瓊脂糖各40ml,煮沸。
4. 取出DTT及IAA復溫。
5. 配置分子量Marker。剪好6張1x0.3 cm的濾紙。低分子量:15μl儲液,30μl 1x sample buffer,45μl sealing buffer。立即混勻,離心恢復體積,稍煮使瓊脂糖溶解,每張濾紙滴加10μl。
6. 取出平衡管復溫。注意防止管蓋暴脫。
7. 配置平衡液。注意在溶解DTT及IAA時不要產生過多氣泡,溶解徹底。
8. 膠條平衡。用具:50ml離心管架子一個。方法:操作在水池邊進行,將平衡管立于架子上。用15ml左右dd水涮洗一次。加DTT平衡液10ml后搖蕩15分鐘,棄液后加IAA平衡液10ml后震蕩15分鐘。棄液,使平衡管立于架子上。將架子轉移至上二向膠工作區。
9. 膠條平衡時。。。。準備上二向膠工作區間,見圖:

 

 
加熱器
量筒
 
架子
車子:玻璃板架,廢液杯,桌布,鑷子兩把,剪刀,尺子,汲水紙,分子量Marker。
操作者
10. 上二向膠。A:倒棄并汲干緩沖液,注意汲水紙不能觸及膠面。B:取3ml左右0.5%瓊脂糖填入玻璃板空隙中,液面不要有氣泡。C:取出膠條(鑷子夾膠條兩邊)后在上槽液中涮洗,將膠條貼于長玻璃板上,堿性端架于space上,依次剪去酸性端和堿性端,靠尺子重力使膠條下降到與page膠面接觸,注意不能有氣泡。
11. 將玻璃板放入電泳槽中。瓊脂糖將凝固時,左右傾斜進入液面后反復上下沖擊可趕走玻璃板下沿氣泡。
12. 蓋上上槽,用瓊脂糖封住上槽與玻璃板之間的空隙。
13. 瓊脂糖將凝時,同時加上、下槽液。蓋蓋,接電源,注意正負極。
14. 電泳程序:2-2.5W/膠 40分鐘;17W/膠,6張膠100W,約6小時。
注:DIGE電泳溫度10℃,避光
 
染色(每個染色盤需染液500ml
膠體考染:
1. 染色液配置:(0.12%G-250、10%(NH42SO4、20%MeOH。
錐形瓶中加入500mlH2O、100mlH3PO4(產熱,緩加混勻)、100g(NH4)2SO4(邊加邊攪拌)再加1.2g G-250再溶解(其實不能真正溶解,用水定容至800ml,邊攪邊加入200ml MeOH。終體積1000ml(可保存半年)。充分溶解需較長時間,整個過程約2h.。
2. 染色:固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night。
       漂洗 H2O 15minX4次。
       染色  室溫搖蕩過夜
       終止 H2O漂洗至背景清楚。
3. 脫色(可選): 50%ACN+50%NH4HCO3(5mM) 2hX2次
                100%ACN    10minX2
                100mM NH4HCO3
熱考染:
1. 0.025%R350配置:1片Phast Gel Blue 溶入1.6L10%的acetic acid中。
2. 將染色液加熱至90℃,傾倒至凝膠上,搖15min。
3. 脫色:10%acetic acid 脫色至背景發白,點清晰可見。
EMBL 銀染:(時間以有一面貼在玻璃板上的膠為例,裸膠時間減半)
1.固定 50%MeOH、5%HA 40min
2.洗滌 50%MeOH          20min
3.洗滌 H2O               ≧2h     洗滌過夜可減少背景。
4.敏化 0.02%Na2S2O3       2min  
5.洗滌 H2O               2min 兩次
6.加銀 0.1%AgNO3         40min
7.洗滌 H2O               2min 兩次
8.顯色 0.04%formalin、2%Na2CO3   顯色液變黃時立即換液,至可見蛋白點時終止。
9.終止 5%HAc
10.保存 1% HAc
Vorum 銀染:(時間以有一面貼在玻璃板上的膠為例,裸膠時間減半)
1.固定 50%MeOH、5%HAc 2h
2.洗滌 35%EtOH 20min    三次
3.敏化 0.02% Na2S2O3       2min
4.水洗 H2O                5min 三次
5.加銀 0.2%AgNO3 0.076%Formalin 20min
6.水洗 H2O                1min 兩次
7.顯色 6% Na2CO3,0.05%formalin,0.0004% Na2S2O3 液體變黃時換液;見點后馬上終止
8.終止 50%MeOH,12%HAc 5min
9.保存 1%HAc 4保存。
 
試劑配置:
1. rehydration buffer stock
          Reagent
Quantity
Final concentration
Urea     (MW 60.06)
     10.5g
          7M
Thiourea (MW 76.12)
       3.8g
          2M
CHAPs   (MW614.89)
        1g
          4%(W/V)

Milli-Q 水至25ml,1.2或0.5ml分裝,-80℃保存可保存半年。
使用前每2.5ml 加入5µl 1%Bromophenol blue solution,15.4mgDTT,0.5%即12.5µl IPG buffer
 
2. Bromophenol blue solution  
Reagent       
Final concentration
   Amount
Bromophenol blue
1%
    100mg
Tris-base
          50mM
    60mg
Double distilled water
 
 to 10ml
室溫保存
3. 4x resollving gel buffer (1.5M Tris-HCl pH8.8 1L)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris -base (Fw121.1)
       1.5M
    181.7g
Double distilled HO
 
    750ml
HCl       (Fw 36.46)
 
adjust to pH8.8
Double distilled water
 
 to   1L
0.45µm過濾,4ºC保存
 
4. 30%T, 2.6% C monomer stock solution
(30%acrylamide, 0.8%N,N’-methylenebisacrylamide, 200ml)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Acrylamide (FW 71.08)
30%
      60.0g
N,N’-methylenebisacrylamide(FW154.17)
0.80%
      1.6g
Double distilled water
 
       to 200ml
0.45µm過濾,4ºC避光保存
 
5. Bind-Silane working solution.
Reagent
Quantity
Ethanol
8 ml
Glacial acetic acid
200µl
Bind-Silane
10µl
Double distilled H2O
1.8 ml
 
6. 10%SDS
Reagent       
Final concentration
     Amount
 SDS (FW 288.38)
           10%(w/v)
       5.0g
Double distilled water
 
       to 50ml
0.45µm過濾,室溫保存。
 
7. 12.5%SDS-PAGE凝膠配方
Reagents
Volumn of reagents
1
2
3
4
5
6
Monomer solution
50.04ml
75.06ml
100.08ml
125.1ml
150.12ml
175.14ml
4×resolving gel buffer
30ml
45ml
60ml
75ml
90ml
105ml
10%SDS
1.2ml
1.8ml
2.4ml
3.0ml
3.6ml
4.2ml
Double distilled water
38.16ml
57.24ml
76.32ml
95.4ml
114.48ml
133.56ml
10%ammonium persulfate
600µl
900µl
1200µl
1500µl
1800µl
2100µl
TEMED
39.6µl
59.4µl
79.2µl
99µl
118.8µl
138.6µl
Total volumn
120ml
180 ml
240 ml
300 ml
360 ml
420 ml
 
8. SDS equilibration buffer
(50mM Tris-HCl Ph8.8 , 6M Urea , 30% glycerol , bromophenol blue 200ml )
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris-HCl pH8.8
          50mM
   20.0ml (13.3ml 4x resollving gel buffer)
Urea (MW 60.06)
            6M
     144.14g
Glycerol (87% v/v)  
         30%(v/v)
     138ml
 SDS (FW 288.38)
         2% (w/v)
     8.0g
Bromophenol blue
         0.002%(w/v)
     800µl of 1%solution
Double distilled water
 
     to 400ml(65ml溶解,再加至400ml)
40ml分裝,-20ºC保存。
 
9. Equilibration of IPG strips prior to SDS PAGE:
2%SDS. 50mMTris Ph8.8. 6M Urea . 30%(v/v)glycerol .  0.002% bromophemol blue
15 min   10ml +100mgDTT
15 min   10ml +250mgIAA
 
10. 10X SDS electrophoresis buffer 
(250Mm Tris-HCl. pH8.3, 1920mm glycine, 1%SDS, 1L)
Reagent       
Final concentration
     Amount
Tris-base (FW 121.1)
          250mM
     30.3g
Glycine    (FW75.07)
          1920mM
     144.0g
SDS        (FW288.38)
          1%(w/v)
     10.0g
Double distilled water
 
     to 1L
 
11. Agarose sealing solution
Reagent       
Final concentration
     Amount
Upper SDS electrophoresis buffer
 
     100ml
Agarose (LM)
0.50%
      0.5g
Bromophenol blue
0.002%(w/v)
200µl
 
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