質譜樣本制備技術服務資料

  
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試劑耗材
Milli-Q waterNon-powder glovesFace maskHat10µl and 200µl tipseppendorf)、Menthol(Fisher M/4056/17)Acetonitrile(Fisher A/0626/17)Trypsin (Promega V528)Trypsin resolve solution(Promega V530)Ammonium bicarbonateSigma A6141)、ZipTip µC-18Millipore ZTC18M096)、TFA(GE HealthCare)0.2ml and 0.5ml EP tube(eppendorf)50ml EP 0.5ml EPCorning
 
用具儀器
真空干燥儀、水浴鍋、10µ200µ移液器、廢液缸、制冰和裝冰設備、200µ管架、剪刀、能裝放置了200µ管管架的塑料盒、200µ管離心機。
 
準備
1.      0.2ml EP管三套,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。
2.      50ml EP管六支,MilliQ水和甲醇各涮一遍,真空干燥。
3.       胰酶儲液制備:使胰酶粉末沉落瓶底,用100µ胰酶重旋液溶解,0.5ml EP分裝成5µl
4.       50ml 100 mM NH4HCO3
 
脫色酶切
1.      切點200µl tip頭剪成吸口1.5mm左右的直徑,MilliQ水涮洗一遍,吸100µl水后戳取斑點,將膠粒打入0.2ml EP管中,吸干水后再用MilliQ水洗滌兩遍,吸干。
2.      脫色 180µl 50%MeOH/50mM NH4HCO3脫色兩次以上,每次半小時;180µl MilliQ水洗滌5分鐘,180µ 50% ACN洗滌5分鐘,180µl 100%ACN洗滌5分鐘;真空干燥半小時。
3.      酶切
A25 mM NH4HCO3稀釋胰酶至12.5µg/µl;每管膠粒加入胰酶3µl,冰浴15分鐘后洗掉多余的胰酶;再加入3µl左右25 mM NH4HCO3至覆蓋膠粒。
B:小心將EP管倒轉,將整個EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴鍋酶切16小時。
C:將塑料盒從37度水中撈出,注意不要倒掉水,冷卻至室溫。
D:加入10µl 25 mM NH4HCO3,震蕩15分鐘,離心后收集至新管;
加入10µl 2.5%TFA,震蕩5分鐘,收集至上管;
加入10µl 2.5%TFA-50% ACN,震蕩5分鐘,收集至上管;
加入10µl 100% ACN,震蕩5分鐘,收集至上管。
E:將此收集液真空濃縮至5-10µl后,加入20µl 0.5%TFA;繼續濃縮至10-20µl
 
肽段濃縮除鹽
A:吸10µl 100% ACN,棄之,重復兩次;
B:吸10µl 0.1% TFA,棄之,重復兩次;
C:吹吸樣本15次;
D:吸10µl 0.1% TFA,棄之,重復兩次;
E:吸3µl 0.1% TFA-50% ACN,將此洗脫液轉入新EP
 
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