western blot技術服務資料

  
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試劑耗材:
SDS、甘油、Tris、溴酚藍、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED,APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量試劑盒、BSA、脫脂奶粉、考麻斯亮藍、麗春紅、氯化鈉、氯化鉀、DTT、ECL、顯影液、定影液等、顯影膠片。
 
儀器設備:
超聲儀、核酸蛋白定量儀、Western-blot電泳轉膜系統、搖床、曝光合、紅燈等。
 
樣本準備:收集106細胞,加入150μl SDS裂解液,冰上超聲5次,定量。
SDS-PAGE 電泳:
1.準備各溶液。  小燒杯兩個,5ml槍頭6個,吸水紙,罐膠電泳設備。
2.準備罐膠槽。  將玻璃板擦干凈,放入短架子內,薄板靠門,兩玻璃板及架子的底緣須在同一平面(否則漏膠);將濕潤的墊片墊于長架子上并鋪上密封膜;將短架子裝在長架子上(短架子底緣須與墊片緊密接觸,否則漏膠)。
3.準備配膠。   將各溶液(ddH2O,單體,Tris-HCl,SDS,TEMED,APS)依次擺好,5ml槍頭插于長罐膠槽,調好取TEMED、APS的槍。
4.配分離膠。   在一小燒杯上裝半杯ddH2O;另一小燒杯依次加上述各液(加TEMED、APS時要迅速),快速搖勻。
                注:膠濃度由需要檢測的蛋白大小決定。
5.罐膠。        從玻璃板中間注入膠液,注膠速度均勻,不要產生氣泡。罐膠后用ddH2O壓膠。
6.等待時:      將Tris-HCl換成pH6.8。換取Tris-HCl及罐膠用的槍頭。調好各移液器。
7.30分鐘后。   倒掉壓膠水,用濾紙吸干殘留水,注意不要觸及膠面。
8.配集成膠。   參見步驟4。
9.罐膠。        參見步驟5,灌滿為止,不要有氣泡。
10.插梳。       梳柱下面不要有氣泡。
11.等待時。     A:配電泳緩沖液。B:將樣本煮沸5分鐘。C:水中冷卻,短暫離心后依加樣序排放好。D:等膠近凝時,將玻璃板裝在電泳架子上,罐內槽液于槽中,檢查是否密封。E:將上槽架子按于槽中。
12.30分鐘后。   罐上槽液超過短玻璃板,拔梳(注意力道適中,不能太快)。放置上樣架子。
13.上樣30μl。   槍頭先伸入至快接近膠面時開始降將上樣液緩緩打出,使樣品液從膠面往上漲,槍頭隨液面上漲而上提。可以不把最后一滴樣品打出,但是每個樣品都須同樣處理。
14.加外槽液。
15.電泳。
轉膜:
1.準備。        分別準備泡膜和轉膜用的試劑和用具,在電泳槽中倒好轉膜液
2.揭膠。        電泳結束后,將電泳槽移至水池中,倒掉電泳液,將內槽提起放在水池邊,取出兩邊玻璃板。用純水沖干凈玻璃板,小心揭開短板,去掉集成膠,小心將膠轉入轉膜液在中。
3.轉膜。        將夾子打開,黑色在底,依次放置海綿、濾紙、膠、膜、濾紙、海綿,關好夾子(均在液面下進行,注意氣泡)快速放入架子中。在電泳槽中放冰袋。
4.電泳。
封閉及孵抗體:
1.轉膜等待時   準備封閉液(即Non-fat milk 5% in TBST)。
2.轉膜完畢后,  將膜放入封閉液中,輕搖孵育1小時。
3.孵一抗。      將封閉好的膜在轉移到一抗盒子中,室溫孵育兩小時或4℃過夜,
4.洗滌          將孵育好一抗的膜在TBST洗滌3次,每次5分鐘。
5.孵二抗。      將洗好的膜放在二抗中室溫孵育兩小時。
6.洗滌。        將孵育好二抗的膜在TBST洗滌3次,每次5分鐘。
7.ECL化學發光和曝光顯影。
western-blot凝膠濃度選擇:
15%
10-45KD
 
7.5%
35-95 KD
12%
12-60 KD
 
5%
55-220 KD
10%
20-80 KD
 
 
 
 
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